分光光度計(jì)的原理和分類

一.分光光度計(jì)的一般原理：

分光光度計(jì)是利用分光光度法，通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。

不同種類的分光光度計(jì)的基本原理相似，都是利用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源。光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，通過測量樣品的吸光值，經(jīng)過計(jì)算可以轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

二.分光光度計(jì)有哪些不同的類型，不同種類的應(yīng)用領(lǐng)域的區(qū)別：

分光光度計(jì)有哪幾種不同的分類方式：

1.分光光度計(jì)按照波長及應(yīng)用領(lǐng)域的不同可以分為：

(1)可見光分光光度計(jì)：測定波長范圍為400～760 nm的可見光區(qū)；

(2)紫外分光光度計(jì)：測定波長范圍為200～400nm的紫外光區(qū)；

(3)紅外分光光度計(jì)：測定波長范圍為大于760nm的紅外光區(qū)；

(4)熒光分光光度計(jì)：用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜；

(5)原子吸收分光光度計(jì)：光源發(fā)出被測的特征光譜輻射，被經(jīng)過原子化器后的樣品蒸氣中的待測元素基態(tài)原子所吸收，通過測定特征輻射被吸收的大小，來求出被測元素的含量。

2.分光光度計(jì)按自動(dòng)化程度分類：可分為手動(dòng)、半自動(dòng)、自動(dòng)分光光度計(jì)。

3.分光光度計(jì)按軟件可分為：帶掃描、不帶掃描。

三.分光光度計(jì)常見的用途：

1.核酸的定量

核酸的高吸收峰的吸收波長260 nm。利用260nm的波長可以定量測量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA的濃度。

除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度。如A260/A280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。

A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。

A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

2.蛋白質(zhì)的直接定量

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。

3.細(xì)菌細(xì)胞密度

細(xì)菌培養(yǎng)過程中，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。

OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。在600nm波長下，以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，測量定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。

四.幾種常見的分光光度計(jì)的用途的區(qū)別：

(1)可見分光光度計(jì)

用來測量待測物質(zhì)對(duì)可見光(400～760nm)的吸光度并進(jìn)行定量分析的儀器，稱為可見分光光度計(jì)。可在600nm測定細(xì)菌細(xì)胞密度。

(2)紫外可見分光光度計(jì)

紫外可見光譜儀用來測量待測物質(zhì)對(duì)可見光或紫外光(200～760nm)的吸光度并進(jìn)行定量分析的儀器。可以測定核酸和蛋白的濃度，也可以測定細(xì)菌細(xì)胞密度。

紫外分光光度計(jì)又可分為單光束,假雙光束,雙光束。它們的用途又有區(qū)別。

單光束：適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。

雙光束：自動(dòng)記錄，快速全波段掃描。可消除光源不穩(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。

假雙光束也就是比例雙光束，它的原理是由同一單色器發(fā)出的光被分成兩束，一束直接到達(dá)檢測器，另一束通過樣品后到達(dá)另一個(gè)檢測器。這種儀器的優(yōu)點(diǎn)是可以監(jiān)測光源變化帶來的誤差，但是并不能消除參比造成的影響。

(3)紅外分光光度計(jì)

一般的紅外光譜是指大于760nm的紅外光譜，這是研究有機(jī)化合物常用的光譜區(qū)域，能分析各種狀態(tài)(氣、液、固)的試樣。

紅外光譜法的特點(diǎn)是：快速、樣品量少(幾微克-幾毫克)，特征性強(qiáng)(各種物質(zhì)有其特定的紅外光譜圖)、能分析各種狀態(tài)(氣、液、固)的試樣以及不破壞樣品。

(4)熒光分光光度計(jì)

熒光分光光度計(jì)是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。應(yīng)用于科研、化工、醫(yī)藥、生化、環(huán)保以及臨床檢驗(yàn)、食品檢驗(yàn)、教學(xué)實(shí)驗(yàn)等領(lǐng)域。

通過對(duì)這些參數(shù)的測定, 不但可以做一般的定量分析，而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化，從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。

(5)原子吸收分光光度計(jì)

該法主要適用樣品中微量及痕量組分分析常規(guī)儀器之一。是材料分析及質(zhì)量控制部門進(jìn)行常量、微量金屬(半金屬)元素分析的有力工具。