液相色譜基礎知識詳解！

　　一：液相色譜法概述

　　液相色譜法(HPLC)是上個世紀七十年代迅速發展起來的一項、快速的分析分離技術，是現代分離測試的重要手段。色譜法的分離原理是：溶于流動相( phase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(station phase)發生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。

　　HPLC是在經典的液相色譜法基礎上發展起來的，其以液體作為流動相，并采用顆粒極細的固定相的柱色譜分離技術。其分離機制與常規柱色譜相同，但填料更加精細，需高壓泵推動，柱效高，分析速度快。與氣相色譜不同的是液相色譜中流動相亦參與組分的分離過程，其組成、比例和pH值可靈活調節，分離模式多樣。在實際操作中主要通過改變流動相的組成來調節樣品在色譜柱的保留值和選擇性，從而使不同樣品得到分離。

　　液相色譜法自20世紀60年代問世以來，由于使用了高壓輸液泵、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測器，實現了對樣品的高速、和高靈敏度的分離測定。液相色譜由于吸取了經典液相色譜的研制經驗，并引入微處理機技術，極大的提高了儀器的自動化水平和分析精度。現在用微處理機控制的液相色譜儀，其自動化程度很高，既能控制儀器的操作參數(如溶劑梯度洗脫、流動相流量、柱溫、自動進樣、洗脫液收集、檢測器功能等)，又能對獲得的色譜圖進行收縮、放大、疊加，以及對保留數據和峰高、峰面積進行處理等，為色譜分析工作者提供了率、功能齊全的分析工具。

　　液相色譜法的應用范圍十分廣泛，對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發性和熱穩定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點、極性、離子型化合物和大分子物質均可用液相色譜法分析測定，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20% ，而80% 則需用液相色譜來分析。HPLC因其具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度好、能分析和分離高沸點且不能氣化的熱不穩定生理活性物質的特點而被廣泛應用于生物化學、藥物及臨床分析，世界各國己將該法收載于藥典。

　　火焰離子化檢測器、手性、化學發光、核磁共振、質譜檢測器等新型檢測技術

　　由于HPLC分析不受溫度和樣品沸點限制，因此具有更廣闊的應用潛力。經過30多年的迅速發展，液相色譜法在基礎理論、儀器裝置和色譜柱等方面的研究已趨于成熟，現已成為化學化工、環境、藥學、食品等多個領域中具優勢的分離分析方法之一。

　　二：基本原理

　　液相色譜根據分離機理的不同可分為：

　　¬液固吸附色譜

　　¬液液分配色譜

　　¬離子交換色譜

　　¬離子對色譜法

　　¬分子排阻色譜(或凝膠滲透色譜)

　　(一)液-固吸附色譜

　　流動相為液體，固定相為固體吸附劑，根據物質吸附作用的不同來分離物質。

　　(二)液-液分配色譜

　　流動相和固定相都是液體的色譜法即為液-液色譜，是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間的分配來進行分離。一種液相為流動相，另一種是涂于載體上的固定相。

　　流動相極性小于固定相極性的液-液色譜法稱為正相分配色譜法。

　　流動相極性大于固定相極性的液-液色譜法稱為反相分配色譜法。

　　(三)離子交換色譜

　　(四)離子對色譜法

　　(五)分子排阻色譜法

　　三：常見故障和維護

　　3.1 HPLC對流動相的一般要求

　　流動相就比如人體的血液，其質量直接影響到整個系統的正常運行與否。

　　應該使用HPLC級的溶劑，不能互相混溶的溶劑不可以直接切換!一般在水相和與其不混溶的溶劑切換時，使用異丙醇作為過渡溶劑。

　　注意溶劑的截止波長。截止波長是指該溶劑可以在紫外檢測器中使用的低波長，低于該波長后，溶劑會有很強的紫外吸收，從而影響極限的穩定性、干擾對所分析物質的檢測。

　　HPLC所使用的水必須是新鮮的和經過0.45μm濾膜過濾過的。建議每天更換新鮮的水。長期不用時，必須把使用水的管路用有機溶劑置換，防止長霉。

　　儀器使用完后要采用適當的溶劑沖洗等方法維護色譜柱和系統。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈。

　　儀器長期不用時，不建議使用純乙腈封存。因為乙腈有生成聚合物的趨勢。建議使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。

　　當有流路堵塞時，可以嘗試將之反接后沖洗。污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長將會縮短溶劑過濾器的使用壽命，并且影響泵和系統的的性能。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH 4 至7) 中尤其如此。

　　3.1.1 過濾器

　　•檢查溶劑過濾器

　　查看過濾器是否變色(尤其是盛放水相的溶劑瓶)–擰開脫氣機出口或比例閥入口管線，此時溶劑會因為重力流出。當脫氣機或溶劑過濾頭堵塞時，溶劑會流出不暢或不流出–臨時取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常。

　　•清潔溶劑過濾器

　　將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下，用水沖洗殘留之溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸(35%左右)的燒杯里浸一小時。用二次蒸餾水*沖洗過濾器至水為中性可以把過濾器放在塑料燒杯內超聲清洗。但是不可使用玻璃器皿將過濾器重新裝好。

　　•建議：定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶(可以高溫滅菌)，每三個月至少清洗一次。

　　3.1.2 泵的使用要點

　　?將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面或較高處。當在四元泵上使用鹽溶液或有機溶劑時，建議將鹽溶液接在下面的梯度閥口上，將有機溶劑接在上面的梯度閥口上，有機溶劑通道好在水或鹽溶液通道的正上面。建議用水定期沖洗所有MCGV通道除去可能在閥口析出的鹽結晶。

　　?操作泵之前，用至少兩個體積(標準脫氣機30mL，對微脫氣機10mL)沖洗真空脫氣機，特別是當泵關閉了一段時間后(例如，過夜)，以及在通道中使用揮發性混合溶劑時，防止溶劑瓶內的玻璃濾頭(過濾器)堵塞及長菌，當濾頭表面有黑色或黃色污染層說明發生了堵塞，應立即清洗或更換。

　　?定期檢查排液閥的過濾白頭。檢查方法：擰開排液閥，以水作流動相。

　　對于標準脫氣機(G1322A)，流速5ml/min水，若壓力大于10bar，則建議更換。

　　對于微量脫氣機(G1379A)，流速2ml/min水，若壓力大于5bar，則建議更換。

　　?當使用低流速時，檢查所有1/16英寸接頭有無滲漏(用壓力測試或漏液測試。每當更換泵密封墊時排液閥慮芯也應更換。

　　?更換活塞密封墊時檢查活塞桿上是否有劃痕。有劃痕的活塞將導致輕度滲漏，并降低密封墊的使用壽命。應盡早更換有劃痕的活塞。

　　?使用緩沖溶液時，關泵前先用水沖洗系統。當需要長時間使 用0.1摩爾或更高濃度的緩沖液時，好選用密封墊清洗附件，以減少對密封墊及活塞桿的磨損。

　　?如果使用了高濃度的緩沖鹽，可以考慮用熱水(50-60℃)來沖洗鹽通道來確保沒有緩沖鹽殘留在系統中。

　　?更換活塞密封墊后應按照密封墊安裝步驟對其進行磨合，但磨合不適用于正相密封墊。

　　?當泵頭安裝有柱塞清洗附件時，由于該附件中也有密封墊，這樣就會增加活塞桿運動時的阻力。所以開泵前一定要用10%異丙醇，并將其流速調至約2-3滴/分鐘使溶液流過沖洗裝置。(對于二元泵SL，如果不使用鹽溶液可以不開)10%異丙醇有助于降低水的表面張力，并有抑菌作用。不要用其它溶劑代替。

　　?當泵頭安裝有沖洗附件而不開啟10%異丙醇，會使密封墊及活塞桿的壽命減短(二元泵SL除外)，泵頭如果發出“吱吱”聲不影響使用和泵的精度如果有必要，可以改變壓縮因子(compressibility)來達到更好的效果。

　　3.1.3 自動進樣器

　　樣品在進樣前必須經過適當的預先處理，需要經過亞微米濾膜的過濾或者離心，防止樣品中的微小顆粒堵塞管路，好使用流動相作為溶劑配制樣品，所用溶劑應該對樣品有較好的溶解性。

　　針座是喇叭口朝上暴露在空氣中的，有時空氣中的較大灰塵顆粒可能恰好落在針座的流路內而引起針座的堵塞。這時候可以嘗試卸下針座，將它接在泵的出口上反沖，一般能解決問題。

　　如果經常使用緩沖溶液，除了泵頭之外，ALS計量泵的柱塞及密封圈，六通閥的轉子密封圈和定子密封圈應該定期清洗，防止有鹽的顆粒磨損ALS一定要使用Agilent的樣品瓶及瓶蓋;使用不兼容的或者加工精度差的樣品瓶及瓶蓋會引起ALS故障率的增加及性能的降低。